Comment construire des vecteurs d'expression

Construction d'un vecteur d'expression

1. Déterminer la séquence d'ADN de la protéine spécifique. Une fois que la séquence d'ADN de la protéine est déterminée, couper la séquence d'ADN du génome en utilisant une enzyme de restriction spécifique. Les enzymes de restriction reconnaissent et coupés à une séquence spécifique du génome.

2. Insérez l'ADN spécifique dans le vecteur. Un vecteur est une molécule d'ADN qui introduit un ADN étranger dans une cellule hôte, en utilisant les enzymes de la cellule pour produire la protéine de l'ADN étranger.

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   Insérer une séquence de promoteur en aval du gène d'intérêt. Un promoteur est une région qui est reconnue par l'ARN polymerase qui se lie à la séquence et commence la transcription du gène. Ajouter l'enzyme ligase pour joindre la séquence de promoteur pour le gène d'intérêt.

4. Insérez le vecteur d'expression dans une cellule hôte par transformation, ce qui induit des trous de passage (à l'aide de sel) dans la membrane cellulaire. Le vecteur d'expression peut ensuite être transcrit en ARNm et traduite en protéine.

Le dépistage d'un vecteur d'expression

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   Effectuez un test de dépistage pour déterminer si la cellule hôte a le vecteur d'expression. La cellule hôte est d'abord plaquée en utilisant la technique aseptique (passage du matériel à travers une flamme) sur une plaque de gélose pour la croissance de la culture cellulaire.

2. Transférer une partie des cellules provenant de la plaque de gélose sur un disque de papier de nitrocellulose. Briser les cellules dans le disque en les traitant avec du sel. Ceci va libérer le contenu des cellules sur le disque.

3. Immerger le disque de papier de nitrocellulose avec une solution d'une sonde d'anticorps spécifique avec un marqueur fluorescent. L'anticorps se lie à la protéine produite par l'ADN d'intérêt.

4. Exposer la nitrocellulose papier disque à la lumière UV. Si la cellule a le vecteur d'expression, la cellule sera une fluorescence sous lumière UV en raison de la liaison de la protéine produite avec l'anticorps avec un marqueur fluorescent.

5. Extraire le produit protéique via purification méthodes- il peut alors être utilisé à des fins médicinales.