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Comment faire des amorces oligonucléotidiques pour la PCR

Pour la réaction en chaîne par polymérase pour amplifier l'ADN correctement, vous avez besoin de deux amorces correctement faites, ou de courtes chaînes de nucléotides qui sont complémentaires à la première partie du segment d'ADN qui est en cours de copie. PCR est utilisée pour une gamme d'applications qui vont de l'application des lois à l'ingénierie génétique. Il consiste à prendre un échantillon de l'ADN double brin, fondre pour briser l'ADN en brins distincts, attacher les amorces pour les simples brins, puis étendre les amorces pour former deux morceaux d'ADN double brin. Ce processus est répété pour obtenir un échantillon plusieurs fois la concentration de l'original.


L'amorce avant que vous ferez doit correspondre avec l'ADN sur le côté opposé, ou brin complémentaire. En d'autres termes, elle doit être composée de ces premiers nucleotides de la séquence d'intérêt. L'amorce inverse doit se lier à la fin de votre gène d'intérêt et imiter votre brin complémentaire.

Instructions



  1. L'utilisation d'un traitement de texte ou un programme plus spécialisé pour l'ADN, regardez la séquence d'ADN que vous souhaitez agrandir. Prenez note des 18-24 premières paires de bases et les 18-24 dernières paires de bases. Ils ne doivent pas être trouvées ailleurs dans votre échantillon d'ADN, ce qui pourrait être commune pour les zones qui se répètent. Si cela se produit, vous allez vous retrouver avec la liaison de votre amorce à de multiples domaines au sein de votre échantillon et résultats de la PCR de longueur variable.

  2. Notez les premiers et derniers segments d'ADN que vous étiez en train de regarder dans la première étape. Par exemple, disons que la séquence commencement était ATGGAATTCACGATCGATCGT et le dernier était GGGTGCGAACACGGACTTAG. Dans cet exemple, nous sommes d'amorçage pour le début et la fin d'un gène particulier.




  3. Prenez la première à 18-24 paires de bases séquence (dans l'exemple, il est ATGGAATTCACGATCGATCGT) et l'insérer dans un autre document de faire l'amorce sens. Enregistrez-le sous le nom de la région que vous voulez amorcer et le fait qu'il est une amorce sens.

  4. Notez les 18-24 dernières paires de bases de la séquence d'intérêt (GGGTGCGAACACGGACTTAG dans l'exemple) pour créer l'amorce inverse. Ecrire les nucleotides complémentaires de la séquence qui représente l'autre côté. Chacun des quatre bases nucléotidiques de l'une des paires avec seulement une autre base: l'adénine (A) avec la thymine (T) et la cytosine (C) avec la guanine (G). Une fois que vous avez l'autre brin complémentaire, vous voulez inverser l'ordre de tous les nucléotides de la chaîne en la réécrivant dans la direction opposée. Lorsque cela est terminé, prenez votre nouvelle séquence complétée et inversée et l'enregistrer dans un document dûment étiquetés.

  5. Allez sur le site de votre fournisseur et insérer la séquence avec le compte pertinent de facturation (habituellement attaché à un laboratoire), la concentration et d'autres modifications spéciales. Passer votre commande.

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